光線通過透明物體如活細菌細胞后，由于受透明物體中密度和折射率不同的物質的影響，部分光線變成了繞射光，光波的相位發生變化，而這種相位差不表現為明暗和顏色上的差異，不能在顯微鏡視野中觀察到。相差顯微鏡就是將經過透明物體的直射光延遲或提前，并和繞射光產生干涉，使相位差變為振幅差。如果產生的干涉為相長干涉(圖Ⅲ-8，R組光線)，則振幅的同相量相加而變大，我們便看到較亮的部分;如果所產生的干涉為相消干涉時(如圖Ⅲ-8，S組光線)，則振幅異相量相消而變小，這部分就變得較暗。這樣，變相位差為振幅差的結果，使原來透明的物體表現出明顯的明暗差異，對比度增加，能更清晰地觀察活細胞的細微結構。